Florey nació en Adelaida, Australia del Sur, hijo del director de una escuela. Asistió al St Peter's College, Adelaide, y a la Universidad de Adelaide, donde se graduó con una licenciatura en ciencias en 1921 y un doctorado en medicina en 1924.
Después de completar su título de médico, Florey trabajó en el Instituto de Investigación Médica Walter y Eliza Hall en Melbourne, donde conoció a Ernst Chain. En 1928, se trasladaron a la Escuela de Patología Sir William Dunn de la Universidad de Oxford, donde comenzaron a trabajar en el desarrollo de la penicilina.
La penicilina fue descubierta en 1928 por Alexander Fleming, pero no se convirtió en un fármaco utilizable. Florey y Chain lograron aislar el ingrediente activo de la penicilina y purificarlo para poder inyectarlo a los pacientes. También desarrollaron métodos para producir penicilina en masa, lo que hizo posible su uso generalizado durante la Segunda Guerra Mundial.
El trabajo de Florey y Chain sobre la penicilina salvó innumerables vidas durante la Segunda Guerra Mundial y revolucionó el tratamiento de enfermedades infecciosas. Florey recibió el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1945 y fue nombrado caballero en 1944.
Florey también fue un distinguido administrador y educador. Se desempeñó como vicerrector de la Universidad de Oxford de 1959 a 1962 y fue presidente de la Royal Society de Londres de 1960 a 1965. También fue miembro de la Academia Australiana de Ciencias y de la Academia Estadounidense de Artes y Ciencias. y la Academia Nacional de Ciencias.
Florey murió de un derrame cerebral en Oxford en 1968. Está considerado uno de los científicos australianos más importantes del siglo XX y su trabajo sobre la penicilina ha salvado millones de vidas.