Nació como Robert John Wagner, Jr. en Cincinnati, Ohio. Sus padres eran Robert John Wagner, Sr., vendedor ambulante de una empresa farmacéutica, y Helen (de soltera Hohman) Wagner, empleada en una panadería. Tenía una hermana menor, Mary Wagner, y un hermano menor, William John Wagner.
La familia de Wagner se mudó a Los Ángeles cuando Bob tenía 12 años. Comenzó a actuar a los 16 años, cuando fue descubierto por un cazatalentos mientras actuaba en una obra de teatro de la escuela secundaria. Firmó con la Agencia William Morris y comenzó a aparecer en pequeños papeles en películas y programas de televisión.
La gran oportunidad de Wagner llegó en 1951 cuando consiguió el papel principal en la película "Con una canción en mi corazón". Luego protagonizó varias películas de éxito, entre ellas "Stars and Stripes Forever" (1952), "The Band Wagon" (1953), "The Eddie Cantor Story" (1953) y "Deep in My Heart" ( 1954).
La carrera televisiva de Wagner comenzó a principios de la década de 1950, cuando apareció en episodios de programas como "Lux Video Theatre" y "The Colgate Comedy Hour". Tenía su propia serie de televisión, "It's Always Jan" (1955-1956), y también protagonizó las comedias "The Bob Wagner Show" (1957-1958) y "The Robert Wagner Show" (1958-1959).
En la década de 1960, Wagner siguió apareciendo en películas y programas de televisión. Protagonizó películas como "Sink the Bismarck!" (1960), "El día más largo" (1962), "La gran carrera" (1965) y "Harper" (1966). También tuvo un papel recurrente en la serie de televisión "The Saint" (1962-1969).
En la década de 1970, la carrera de Wagner comenzó a decaer. Apareció en menos películas y programas de televisión y, a menudo, tuvo que asumir papeles secundarios. Sin embargo, sí protagonizó las exitosas miniseries "Masada" (1981) y "Sins of the Father" (1984).
En la década de 1980, la carrera de Wagner se recuperó. Protagonizó la exitosa serie de televisión "Hart to Hart" (1979-1984) y "Scarecrow and Mrs. King" (1983-1987). También apareció en varias películas de éxito, entre ellas "Ice Station Zebra" (1968), "The Towering Inferno" (1974) y "The Pink Panther Strikes Again" (1976).
En la década de 1990, Wagner siguió apareciendo en películas y programas de televisión. Protagonizó películas como "Dragonfly" (2002) y "Austin Powers in Goldmember" (2002). También tuvo un papel recurrente en la serie de televisión "Monk" (2002-2009).
La última actuación cinematográfica de Wagner fue en la película de 2008 "La segunda oportunidad". Murió de neumonía el 18 de marzo de 2008.
Wagner estuvo casado tres veces. Estuvo casado por primera vez con la actriz Natalie Wood de 1957 a 1962. Tuvieron una hija juntos, Natasha Gregson Wagner. Luego estuvo casado con la actriz Marion Marshall de 1963 a 1970. Tuvieron dos hijos juntos, Katie Wagner y Joshua Wagner. Finalmente estuvo casado con la actriz Jill St. John desde 1990 hasta su muerte en 2008.
Wagner fue un actor de éxito con una carrera que abarcó más de seis décadas. Protagonizó más de 100 películas y programas de televisión y era una figura querida en Hollywood.